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电泳分离的原理是什么意思-科普:电泳原理的分析模式
发布日期:2022-12-10 10:17:31
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第八部分聚丙烯酰胺凝胶电泳 一 、电泳的原电泳的分电泳原理 电泳是分离指带电粒子在电场中向与自身所带电荷相反的电极移动的现象。在生物化学和分子生物学中 ,意思原理主要根据生物大分子所带电荷的科普多少和在分子表面排列的差异来分离和鉴定生物大分子 。电泳现象早在 1809 年就被发现 ,析模但这种现象在生物化学领域的电泳的原电泳的分应用在 19 世纪初才萌芽 。1907年 ,分离有人研究了白喉毒素在琼脂中的意思原理电泳;1937年 ,瑞典建立“边界位移电泳”(EP),科普成功地将血清蛋白质分为五种主要成分  ,析模即白蛋白 、电泳的原电泳的分α1-、分离α2- 、意思原理β-和γ-球蛋白。科普在随后的析模几十年里,电泳技术发展迅速 ,各种类型的电泳技术相继诞生 。按所用固体支持物不同 ,有纸电泳 、醋酸纤维素膜电泳 、纤维素或淀粉粉电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 、琼脂糖凝胶电泳等 。电泳技术 1. 1. 微量电泳 2. 2. 微量电泳 3. 3. 等电聚焦电泳 4. 4. 等速电泳 5. 5. 密度梯度电泳是一种游离电泳载体的电泳技术 。1. 纸上电泳 2. 2. 醋酸纤维素膜电泳 3​​. 3. 薄层电泳 4. 4. 非凝胶支持物 区带电泳支持物包括  :淀粉 ,纤维素粉,玻璃粉硅胶、合成树脂粉 5. 5.凝胶支持区电泳 (1)淀粉凝胶 (2)聚丙烯酰胺 ①圆盘电泳法 ②平板法 ③SDS-凝胶电泳法 (3)琼脂糖凝胶电泳 (4)琼脂糖凝胶电泳包括常压 、高压电泳(水平或垂直) 水平或垂直(平板法、柱法和丝法) 垂直(柱法) 垂直或水平 垂直(分子量测量)平板法或柱 其他使用方法(如免疫电泳) 1. 1. 二维电泳 2. 2. 电泳色谱联用 3. 3.交叉电泳纸4. 4.连续低位电泳等;通过电泳区分,有的在液体介质中进行 ,

由于电泳与光学装置、自动记录仪、自动分部收集器相结合 ,形成等电点聚焦仪 、等速电泳仪等  。毛细管电泳( ) ,于20世纪80年代后期发展起来 ,是在毛细管中加载缓冲液,在毛细管的一端,并在毛细管的两端施加直流高压,实现样品的分离……这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。电泳按其分离原理大致可分为四类:区带电泳(zone EP ,ZEP) 、边界位移电泳(EP,MBEP) 、等速电泳(  ,ITP)和等电聚焦(,IEF)。各种电泳分离的原理简述如下: 1. 区带电泳如图1(a)所示 ,不同的离子组分在均匀的缓冲体系中分离成独立的区带,可以通过染色等方法显示出来,也可以用密度计扫描得到。顶峰 。随着时间和距离的延长 ,电泳区扩散严重 ,影响分辨率 。加入不同的介质可以减少扩散,特别是在凝胶中 ,凝胶还起到分子筛的作用,大大提高了分辨率,是应用最广泛的电泳技术 。2. 如图1(b)所示,边界位移电泳只能起到部分分离的作用。如果将浓度与距离作图,可以获得阶梯状的图形。前面的成分有的是纯的 ,有的是纯的 。然后相互重叠 。

电泳分离的原理是什么意思-科普:电泳原理的分析模式

每个界面都可以通过光学方式显示 ,这是最早建立的电泳方式 。3. 等速电泳如图 1(c) 所示 。电泳达到平衡后,各区带相互跟随 ,分成清晰的界面 ,并以恒定的速度移动。距离与浓度图也是阶梯状的 ,但与上述边界移动电泳不同的是 ,它的区域不重叠 ,而是分开保存。4. 等电聚焦 如图1(d)所示,各种等电点不同的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度,分离的物体向其等电点移动并汇聚成高分辨率的窄带. abcd 图1 不同电泳方法分离原理示意图 a.区带电泳;b. 移动界面电泳;C。等速电泳;d. 等电聚焦电泳以其快速 、简便 、分辨率高等优点而得到广泛应用。从无机离子的分离分析到复杂的生物高分子化合物,在放射化学和免疫化学中发挥着重要作用;多用于生化实验室和生化行业;它还用于制药部门的临床诊断。在各种电泳技术中  ,凝胶电泳在酶 、蛋白质、核酸等生物大分子的分离分析中分辨率最高,为生物化学和分子生物学的发展做出了巨大贡献 。本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和技术 。(1) 迁移率() 1.电泳的速度假设溶液中有一个带正电荷Q的粒子 ,在强度为E的电场作用下移动 ,带电粒子所受的力是F=QE  。

电泳分离的原理是什么意思-科普:电泳原理的分析模式

同时 ,粒子的运动受到相反方向的摩擦力F1=fv的阻碍 ,其中f代表摩擦系数,v代表速度 。当这两个力相等时 ,粒子以速度 v 向前移动(图 2)  。即QE=fv………………………………………………(1)v=QE/f………………………………………… ………………(2) Hv+ _F′ =fvF =QEQ 图2带电粒子在电场中迁移的受力情况 摩擦系数f与扩散系数D的关系为f= KT/D………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………… (3) 其中K为布氏常数,T为绝对温度,因此可由 求出扩散系数 。根据斯托克定律 ,球形分子在溶液中游动的阻力 1=6π rη V…………………………………………………………………………(4)Fr为粒子半径, η 是介质粘度 ,v 是游泳速度。1 = f V 可以比较公式: (4) 公式同Ff=6π rη ………………………………………………………………………… …………(5) (5) 代入式(2)可得  : V=QE/6π rη ……………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… 电场中的电泳速度v与电荷Q与电场强度E成反比 ,与粒子半径r和液体粘度系数η成反比 。

即粒子在同一电场中,在同一介质中 ,如果电荷不同或粒子大小不同 ,则电泳速度不同 ,因此电泳能使粒子分离 。2. 迁移率粒子在电场中移动的速度一般不以电泳速度来表示  。由于同一粒子在不同电场下的电泳速度不同 ,由式(2)或(4)可知 ,速度是电场强度的函数,V = f(E),v不能反映粒子本身的特性  。因此,粒子运动的速度通常用迁移率μ或m来表示。迁移率是带电粒子在单位电场强度下的电泳速度。即:μ =v/E=(d/t) /(V/l) =dl/Vt(cm2·v-1·s-1) ………………………………(7) d为粒子游动距离(cm), l为支架的有效长度(cm), V为实际施加在支架两端的电压(v), t为通电时间(s) (6) 代入(7): μ =Q/6π rη ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… (8) ,与半径和介质的粘度 ,而与电场强度无关。因此,在一定条件下,某种物质的迁移率是恒定的 ,这就是该物质的物理化学特性的常数 。3.有效迁移率可由迁移率μ=v/E的定义求得为v=μE………………………………………………………………(9)那是 ,

由于溶液中电解质的不同电离程度对离子迁移速度有很大影响 ,因此,在实际电泳过程中 ,离子在电场力作用下的电流速度由下式确定. v =α μ E……………………………………………………………………………… (10) 其中α为电离度 ,μ为离子淌度,α μ称为有效迁移率。显然,带电粒子的有效迁移率越大,其电泳速度就越大  。在讨论聚丙烯酰胺凝胶电泳时,离子有效迁移率是一个有用的物理量  。因为在粗孔凝胶中电泳分离的原理是什么意思,对于 - 和随后的离子甘氨酸盐 G 确保蛋白质 p 夹在前面的离子 Cl- 之间以浓缩蛋白质样品并将其压成薄片,需要为粗孔凝胶设计一个缓冲体系,使其维持一个pH值引起的离子解离程度恰好满足以下关系 ,即α C1- m C1- > α P- m P - > α G- m G- 这是同量级电场强度下离子在粗孔凝胶中的实际迁移 。式中的m为离子淌度u 。之所以改符号 ,是因为使用的单位常以10-5cm2·V-1·s-1为m单位。分离组分电泳到细孔凝胶后 ,由于蛋白质要在该分离胶中分离成条带 ,而甘氨酸自由基不影响蛋白质的分离 ,因此需要设计另外的pH缓冲体系以满足α C1- m C1->α G mG>

(2)影响电泳的外部因素电泳速度不仅受粒子本身性质的影响 ,如带电性 、直径等 ,还受其他外部因素的影响。1. 1. 电场 (1) (1) 电场强度(电位梯度) 电场强度是指单位长度的电压降(v/cm)  。从式(2)可以看出 ,电场强度E对电泳速度起着非常重要的作用 。电场强度越大,电泳速度越快,单位时间内粒子迁移距离越大 ,电泳时间可缩短 。根据电场强度的大小 ,电泳可分为两类:常压电泳(100-500v)和高压电泳(500-1000v)。前者电场强度一般为2-10v/cm ,后者为20-200v/cm。常压电泳分离时间长 ,需数小时至数天 ,多用于大分子物质的分离 。高压电泳分离时间短,有时只需几分钟,多用于小分子物质的分离 。在实际工作中 ,有时需要快速电泳 。如果没有高压电泳设备 ,人们往往利用上述原理将常压电泳槽小型化,缩短支撑介质两端的距离。例如 ,如果两端之间的距离从 20cm 更改为 5cm ,外加电压仍为200v  ,但电场强度由10v/cm变为40v/cm ,加快了电泳速度 。有时为了减慢样品的迁移率  ,也可以通过调节电压来降低电位梯度 。

(2)铂丝多用作电极和电极反应电泳的电极材料 ,铂丝的放置位置影响电场强度。如果两个电极之间的铂丝位置放置不当  ,电场强度不均匀 ,往往会使电泳带弯曲或同一样品的迁移率不同 。通电时电极两端会发生电解反应:正极(氧化电极)H2O→2H++1/2O2↑+2e-→2OH-负极(还原电极)2H2O+2e-+H2↑因此,在电泳过程中 ,负极处可见正极气体产生(负极有密集的氢气泡 ,正极有较大的氧气气泡)  。电泳后 ,两个电泳槽的 pH 值可能相差很大(2 至 4 PH)。另外,电泳过程中会产生热量,尤其是高压电泳,所以高压电泳槽要配备降温设备,常压电泳可以放在冰箱中降温  。2.缓冲液 缓冲液的组成和浓度决定并稳定了支持介质的pH值和溶液的离子强度  ,影响带电粒子的迁移率 。(1) (1) 成分 电泳常用的缓冲液有  :巴比妥酸盐(钠);硼酸(钠);磷酸盐;Tris等。缓冲液组分应根据电泳类型和对象选择。例如,巴比妥-巴比妥钠缓冲液可用于纸电泳分离血清蛋白 ,Tris-甘氨酸缓冲液常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶。对缓冲液组分的一般要求:不使样品变性 ,不改变支持物的理化性质,不影响电泳后染色 ,有利于电泳和样品的分离 。

(2)浓度主要影响溶液的离子强度(μ)。离子强度是离子浓度 (Ci) 和离子价数 (zi) 的函数 μ = f(ci, zi) 稀溶液的离子强度可以通过以下公式计算 SCiZiμ = 1/2Σ 12 其中 s 表示一共有s种离子;Ci是离子的摩尔浓度;zi 是离子的化合价 。例如0.01mol/L加0.02mol/L NaCl溶液的离子强度应为:2+0.01×2μ=1/2(0.01×12+0.02×12+0.02×12)=0 。045 离子强度越高 ,粒子迁移越慢 。在电解质溶液中,带电粒子可以吸引周围一些带相反电荷的离子 ,形成离子扩散层。一方面影响粒子携带的电荷,降低其在电场中的电场力F电泳分离的原理是什么意思 ,从而影响迁移速度(公式2);另一方面 ,当施加电场时,粒子向与其电荷相反的电极移动 ,即带正电的粒子向负极移动  ,带负电的粒子向正极移动 ,离子扩散由于与粒子符号相反的多余电荷 ,层向相反方向移动 。结果 ,由于粒子与离子扩散层之间的静电引力,粒子迁移速度减慢。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的 。若考虑离子强度的影响: μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数,25℃时,k = 0.33×103,μ为离子强度。当施加电场时,粒子向与其电荷相反的电极移动,即带正电的粒子向负极移动,带负电的粒子向正极移动,离子扩散层向相反方向移动方向是由于与粒子符号相反的多余电荷 。结果,由于粒子与离子扩散层之间的静电引力  ,粒子迁移速度减慢。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的  。若考虑离子强度的影响 : μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数 ,25℃时,k = 0.33×103,μ为离子强度。当施加电场时 ,粒子向与其电荷相反的电极移动 ,即带正电的粒子向负极移动,带负电的粒子向正极移动 ,离子扩散层向相反方向移动方向是由于与粒子符号相反的多余电荷。结果 ,由于粒子与离子扩散层之间的静电引力,粒子迁移速度减慢 。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的。若考虑离子强度的影响: μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数  ,25℃时,k = 0.33×103 ,μ为离子强度 。带正电的粒子向负极移动 ,带负电的粒子向正极移动,离子扩散层由于与粒子符号相反的多余电荷而向相反方向移动 。结果,由于粒子与离子扩散层之间的静电引力 ,粒子迁移速度减慢 。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的 。若考虑离子强度的影响 : μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数,25℃时 ,k = 0.33×103 ,μ为离子强度。带正电的粒子向负极移动,带负电的粒子向正极移动,离子扩散层由于与粒子符号相反的多余电荷而向相反方向移动。结果 ,由于粒子与离子扩散层之间的静电引力,粒子迁移速度减慢。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的。若考虑离子强度的影响 : μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数,25℃时,k = 0.33×103,μ为离子强度。由于粒子与离子扩散层之间的静电引力 ,粒子迁移速度减慢 。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的。若考虑离子强度的影响 : μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数,25℃时 ,k = 0.33×103,μ为离子强度 。由于粒子与离子扩散层之间的静电引力,粒子迁移速度减慢。上式(8)是从理想绝缘系统推导出来的。若考虑离子强度的影响: μ = (Q/6π rη ) / (1+kμ1/2r) k为常数 ,25℃时,k = 0.33×103 ,μ为离子强度  。

当缓冲溶液浓度低时 ,离子强度降低 ,会影响溶液的电导率,增加样品分子的扩散,降低分辨率 。因此 ,缓冲液的离子强度应有一个合适的范围 ,一般控制在0.02~0.2之间 。(3)PH 溶液的PH值决定了带电粒子的离解程度,决定了物质所带电荷的性质和数量,也决定了样品的迁移方向。以蛋白质为例 ,当溶液的pH值低于蛋白质的等电点时,蛋白质分子带正电荷 ,成为阳离子;当溶液的pH值高于等电点时 ,蛋白质分子带负电荷 ,成为阴离子  ,pH值离等电点越远 。粒子越远 ,粒子携带的净电荷越多,迁移速度越快,反之亦然 。图 3 显示了蛋白质分子在不同 pH 条件下的带电状态及其在电场中的运动状态 。PH PHPI 蛋白质分子电荷 + H3N-R-COOH + H3N -R-COO- H2N-R-COO- 离子形成阳离子 两性离子 阴离子在电场中迁移方向向阴极而不是向 Anode 图3 蛋白质分子在不同pH条件下所带电荷及其在电场中的迁移方向示意图。因此,在分离蛋白质混合物时 ,应选择能扩大各种蛋白质所带电荷差异的pH缓冲液。在电泳过程中,正负电极的连接也应随pH的变化而变化。例如 ,在碱性条件下,蛋白质带负电,正极应接在远离样品的一侧  ,这样蛋白质才能在支持物上定向迁移。

3.支持物 大多数电泳都有支持物,如纸电泳 、醋酸纤维素膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等 。然而,载体的结构和性能对带电粒子的迁移率有很大的影响,主要体现在样品的吸附上。 ,导致电渗和分子筛效应。载体对样品的吸附增加了带电粒子电泳过程中的摩擦力 。一方面降低迁移速度,另一方面样本拖尾,因此分辨率降低。液体在电场中相对于固体载体的相对运动称为电渗 。例如 ,在纸张电泳中,由于构成纸张的纤维素带负电,

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